１．８ 麦康凯琼脂（附录三９）
１．９ 柯凡克试剂（附录二４）
１．１０ 甲基红指示剂（附录二４）
１．１１ Ｖ－Ｐ试剂（附录二４）
１．１２ 革兰氏染色液（附录二１）
２．检验程序
－－－－－
｜供试品｜
－－－－－
↓
－－－－－
｜供试液｜
－－－－－
↓
－－－－－－－－－－－
｜ ＢＬ增菌液 ｜
－－－－－－－－－－－
３６±１℃↓１８～２４小时
－－－－－－－－－－－
｜ＥＭＢ或麦康凯琼脂｜
－－－－－－－－－－－
３６±１℃↓１８～２４小时
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｜ ｜
疑似菌落生长 无菌落生长
↓ ↓
－－－－－－－－－－ －－－－
｜普通肉汤琼脂斜面｜ ｜报告｜
－－－－－－－－－－ －－－－
３６±１℃ ↓ １８～２４小时
－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－
↓ ↓ ↓
－－－－－ －－－ －－－－－－－－－
｜革 镜｜ ｜乳｜ ｜靛｜甲｜Ｖ｜柠｜
｜兰 ｜ ｜ ｜ ｜ ｜ ｜｜｜檬｜
｜氏 ｜ ｜ ｜ ｜基｜基｜Ｐ｜酸｜
｜染 ｜ ｜ ｜ ｜ ｜ ｜试｜盐｜
｜色 检｜ ｜糖｜ ｜质｜红｜验｜ ｜
－－－－－ －－－ －－－－－－－－－
｜ ｜ ３６±１℃ ２４～４８小时｜
－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－
↓
－－－－－
｜报 告｜
－－－－－
３．操作步骤
３．１ 增菌培养 取供试液（总则５）１０ｍｌ，加入备妥的１００ｍｌＢＬ增菌液内，置３６±１℃培养１８～２４小时。增菌液呈现混浊。液面可见或未见气泡都表明有菌生长，如未见明显混浊，可延长增菌培养时间至４８小时。
３．２ 分离培养 将上述增菌培养液轻微摇动，以接种环沾取１～２环划线接种于ＥＭＢ或麦康凯琼脂平板上。置３６±１℃培养１８～２４小时（必要时延长培养时间），观察菌落生长情况，大肠杆菌在ＥＭＢ琼脂平板上的典型菌落呈深紫黑色或中心深紫色，圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑，常有金属光泽；在麦康凯琼脂平板上的典型菌落呈桃红色或中心桃红、圆形，扁平，光滑湿润。由于药物影响或非典型菌的存在，大肠杆菌可出现非典型形态；在ＥＭＢ琼脂平板上呈现浅紫、粉紫、粉色，无明显暗色中心；在麦康凯琼脂平板上呈现微红色或粉色，菌落形态、质地也有改变。以上形态均应作为疑似菌落进行鉴定，切勿遗漏。
分离平板上无菌落或无疑似菌落生长，可作出未检出报告。
以接种针轻轻接触单个疑似菌落的中心，沾取培养物，每次应挑取２个或更多个疑似菌落，接种于普通肉汤琼脂斜面或三糖铁琼脂斜面上。置３６±１℃培养１８～２４小时，供革兰氏染色镜检及生化试验用。
在上述检验过程中若发现疑似的其它规定控制菌时，亦应继续鉴定。
３．３ 革兰氏染色镜检 将上述普通肉汤琼脂斜面培养物涂片，作革兰氏染色镜检。大肠杆菌为革兰氏阴性无芽孢短杆菌。由于菌龄等原因，菌体长短可有变化。
３．４ 生化反应
３．４．１ 将上述斜面培养物接种于乳糖发酵管，置３６±１℃培养２４～４８小时，观察结果。大肠杆菌应发酵乳糖并产酸产气，或产酸不产气。产酸者，以酸性复红为指示剂的培养基显红色；以溴麝香草酚蓝为指示剂的培养基显黄色。产气者，倒管内有气泡。
为避免迟缓发酵乳糖造成假阴性，可选用５％乳糖发酵管。绝大多数迟缓发酵乳糖的细菌可于２４小时内出现阳性反应。
３．４．２ ＩＭＶｉＣ试验
靛基质试验 将斜面培养物接种于蛋白胨水培养基中，置３６±１℃培养４８±２小时。沿管壁加入柯凡克试剂０．３～０．５ｍｌ，轻微摇动，观察液面颜色。阳性反应为玫瑰红色；阴性反应为试剂本色。
甲基红试验 将斜面培养物接种于磷酸盐葡萄糖蛋白胨水培养基中，置３６±１℃培养４８±２小时。于每ｍｌ培养液中加入甲基红指示剂１滴，立即观察结果，阳性反应培养液为鲜红色或桔红色；阴性反应呈黄色。
Ｖ－Ｐ试验 将斜面培养物接种于磷酸盐葡萄糖蛋白胨水培养基中，置３６±１℃培养４８±２小时。于每２ｍｌ培养液中加入Ｖ－Ｐ试剂甲液（６％ａ－萘酚酒精溶液）１ｍｌ，混匀，再加Ｖ－Ｐ试剂乙液（４０％ＫＯＨ）０．４ｍｌ，充分振摇，观察结果。阳性反应立刻或数分钟后出现红色。加试剂后４小时无红色反应时为阴性，如出现红色亦应判为阳性。
柠檬酸盐利用试验 将斜面培养物接种于西蒙氏柠檬酸盐斜面，置３６±１℃培养４８±２小时，观察结果。斜面有菌苔生长，培养基由绿色变为蓝色时为阳性反应；斜面无菌苔生长，培养基颜色无改变为阴性反应。若斜面有微量菌苔生长或颜色改变等可疑现象时，应将待检菌株重新分离、纯化后，再行试验。
大肠杆菌ＪＭＶｉＣ反应模式应为＋＋－－或－＋－－。对出现可疑反应的培养物，应将所分离的待检菌株于ＥＭＢ或麦康凯琼脂平板上重新划线分离后，再作生化试验证实。
表２： 大肠杆菌同有关细菌的ＩＭＶｉＣ鉴别及应用
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｜ ｜ 靛基质 ｜ 甲基红 ｜Ｖ Ｐ｜ 柠檬酸盐 ｜
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｜ 典型大肠杆菌 ｜ ＋ ｜ ＋ ｜ － ｜ － ｜
｜ 非典型大肠杆菌 ｜ － ｜ ＋ ｜ － ｜ － ｜
｜－－－－－－－－－－－｜－－－－－｜－－－－－｜－－－｜－－－－－－｜
｜ 典型中间型 ｜ ＋ ｜ ＋ ｜ － ｜ ＋ ｜
｜ 非典型中间型 ｜ － ｜ ＋ ｜ － ｜ ＋ ｜
｜－－－－－－－－－－－｜－－－－－｜－－－－－｜－－－｜－－－－－－｜
｜ 典型产气肠杆菌 ｜ － ｜ － ｜ ＋ ｜ ＋ ｜
｜ 非典型产气肠杆菌 ｜ ＋ ｜ － ｜ ＋ ｜ ＋ ｜
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４．结果报告 完全符合以下结果时，判定为检出大肠杆菌
（１）染色镜检是革兰氏阴性无芽孢杆菌；
（２）乳糖发酵产酸产气，或产酸不产气；
（３）ＩＭＶｉＣ试验反应为＋＋－－或－＋－－。
沙门氏菌检验法
沙门氏菌为肠杆菌科沙门氏菌属细菌，广泛分布于自然界，是人畜共患的肠道病原菌，常引起伤寒、肠炎、肠热症和食物中毒，危害人类健康。沙门氏菌可通过人类、畜、禽的粪便或带菌者直接或间接污染药品，生产环境及生产的各个环节，特别是以动物、脏器为原料的药品污染机率较高。受到污染的药品，不仅直接影响服用者的安全，并可造成沙门氏菌的传播和流行。故对某些药品必须检查沙门氏菌。
药品中污染的沙门氏菌常在生产过程中受到损伤而处于濒死状态，故检验时须先在无选择性的增菌液中使其复苏，然后再进行选择性增菌。
１．培养基、试剂
１．１ 普通肉汤培养基（附录三１）
１．２ 四硫磺酸盐增菌液（附录三１５）
１．３ 胆盐硫乳（ＤＨＬ）琼脂（附录三１７）
１．４ 沙门氏菌属志贺氏菌属（Ｓ．Ｓ）琼脂（附录三１８）
１．５ ＥＭＢ琼脂（附录三８）
１．６ 麦康凯琼脂（附录三９）
１．７ 三糖铁（ＴＳＩ）琼脂（附录三１６）
１．８ 蛋白胨水培养基（附录三１０）
１．９ 尿素琼脂培养基（附录三１９）
１．１０ 氰化钾培养基（附录三２０）
１．１１ 赖氨酸脱羧酶培养基（附录三２１）
１．１２ 糖发酵培养基（附录三１３）
１．１３ 半固体肉汤琼脂（附录三３）
１．１４ 沙门氏菌属Ａ－Ｆ“０”多价血清
１．１５ 革兰氏染色液（附录二１）
１．１６ 柯凡克试剂（附录二４）
２．检验程序
@@ ３．操作步骤
３．１ 增菌培养 取供试液（总则５）１０ｍｌ，加入备妥的１００ｍｌ普通肉汤内，混匀。置３６±１℃培养１８～２４小时。轻微摇动培养液，取１ｍｌ加入含１０ｍｌ四硫磺酸盐增菌液的试管内，再置３６±１℃培养２４±２小时。如有菌生长，增菌培养液变混。
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｜供试品｜
－－－－－
↓
－－－－－
｜供试液｜
－－－－－
↓
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｜ 营养肉汤 ｜
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３６±１℃ ↓１８～２４小时
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｜ 四硫磺酸盐增菌液 ｜
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３６±１℃ ↓２４±２小时
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｜ ＤＨＬ琼脂平板 ＥＭＢ琼脂平板 ｜
｜ （或ＳＳ琼脂平板） （或麦康凯琼脂平板）｜
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３６±１℃ ↓２４±２小时
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｜ ＴＳＩ琼脂斜面 ｜
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３６±１℃ ↓２４±２小时
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↓ ↓ ｜ ｜
－－－ －－－ －－－－－－－－－－－－－－－－ ｜
｜革｜ ｜半｜ ↓ ↓ ↓
｜兰｜ ｜固｜ －－－ －－－ －－－ －－－ －－－
｜氏｜ ｜体｜ ｜靛｜ ｜尿｜ ｜赖｜ ｜氰｜ ｜血｜
｜染｜ ｜肉｜ ｜ ｜ ｜ ｜ ｜氨｜ ｜ ｜ ｜清｜
｜色｜ ｜汤｜ ｜基｜ ｜素｜ ｜酸｜ ｜化｜ ｜学｜
｜镜｜ ｜琼｜ ｜ ｜ ｜ ｜ ｜脱｜ ｜ ｜ ｜试｜
｜检｜ ｜脂｜ ｜质｜ ｜酶｜ ｜羧｜ ｜钾｜ ｜验｜
｜ ｜ ｜ ｜ ｜ ｜ ｜ ｜ ｜酶｜ ｜ ｜ ｜ ｜
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｜ ｜ ｜ ｜ ｜ ｜ ｜
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↓
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｜报 告｜
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３．２ 分离培养 轻微摇动增菌培养液，以接种环沾取１～２环接种于ＤＨＬ（或Ｓ．Ｓ）琼脂平极及ＥＭＢ（或麦康凯）琼脂平板各１个。于３６±１℃培养２４±２小时，检查平板上有无疑似沙门氏菌落。沙门氏菌在上述平板上典型菌落形态见表３。
表３： 沙门氏菌在选择性平板上的菌落特征
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｜ 培 养 基 ｜ 菌 落 特 征 ｜
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｜ ＤＨＬ琼脂 ｜无色至浅橙色，半透明，多数菌株菌落中心带黑色或几乎｜
｜ ｜全黑色 ｜
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｜ ＳＳ琼脂 ｜无色至浅橙色，半透明或不透明，有的菌株菌落中心带黑｜
｜ ｜色 ｜
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｜ ＥＭＢ琼脂 ｜无色至浅橙色，透明或半透明，光滑湿润 ｜
｜－－－－－－－－｜－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－｜
｜ 麦康凯琼脂 ｜无色至浅橙色，透明或半透明，有时中心暗色 ｜
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由于药物的影响或非典型菌株的存在，沙门氏菌菌落可呈现非典型形态，如色泽变深，菌落粗糙等，应注意挑选。
３．３ 初步筛选试验 以接种针轻轻接触菌落的中心部位，沾取选择性平板的疑似菌落２个或更多个，划线接种于ＴＳＩ琼脂斜面并穿剌底层。置３６±１℃培养２４±２小时观察结果。沙门氏菌在ＴＳＩ琼脂斜面的反应为：斜面呈碱性（红色），底层呈酸性（黄色），硫化氢阳性（底层黑色）或阴性（无黑色）。
沙门氏菌及有关细菌在ＴＳＩ琼脂上的反应见表４。
表４： 沙门氏菌及其它细菌在ＴＳＩ琼脂的反应结果
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｜序 号｜斜 面｜底 层｜产 气｜硫化氢｜ 可能的菌属 ｜
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｜ １ ｜ － ｜ ＋ ｜＋／－｜ ＋ ｜沙门氏菌属、变形杆菌属、柠檬酸杆菌｜
｜ ｜ ｜ ｜ ｜ ｜属、爱德华氏菌属 ｜
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｜ ２ ｜ － ｜ ＋ ｜ ＋ ｜ － ｜沙门氏菌属、埃希氏菌属、哈夫尼亚菌｜
｜ ｜ ｜ ｜ ｜ ｜属、摩根氏菌属、普罗菲登斯菌属 ｜
｜－－－｜－－－｜－－－｜－－－｜－－－｜－－－－－－－－－－－－－－－－－｜
｜ ｜ ｜ ｜ ｜ ｜沙门氏菌属、志贺氏菌属、埃希氏菌 ｜
｜ ３ ｜ － ｜ ＋ ｜ － ｜ － ｜属、哈夫尼亚菌属、摩根氏菌属、普罗｜
｜ ｜ ｜ ｜ ｜ ｜菲登斯菌属 ｜
｜－－－｜－－－｜－－－｜－－－｜－－－｜－－－－－－－－－－－－－－－－－｜
｜ ４ ｜ ＋ ｜ ＋ ｜＋／－｜ ＋ ｜亚利桑那菌、柠檬酸杆菌属、变形杆菌｜
｜ ｜ ｜ ｜ ｜ ｜属 ｜
｜－－－｜－－－｜－－－｜－－－｜－－－｜－－－－－－－－－－－－－－－－－｜
｜ ５ ｜ ＋ ｜ ＋ ｜＋／－｜ － ｜埃希氏菌属、肠杆菌属、克雷伯氏菌 ｜
｜ ｜ ｜ ｜ ｜ ｜属、沙雷氏菌属、柠檬酸杆菌属 ｜
｜－－－｜－－－｜－－－｜－－－｜－－－｜－－－－－－－－－－－－－－－－－｜
｜ ６ ｜ － ｜ － ｜ － ｜ － ｜ 产碱杆菌、假单胞菌属 ｜
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