３．选择性培养基
（１）对氨基苯甲酸培养基（用于碘胺类药物的无菌检查）照上述液体硫乙醇酸盐培养基及霉菌培养基的处方及制法，各加对氨基苯甲酸０．１２５ｇ，溶解后摇匀，分装，１１５℃灭菌３０分钟。
（２）吐温培养基（用于油剂药品的无菌检查）照上述液体硫乙醇酸盐及霉菌培养基的处方及制法，各加吐温－８０ １０ｍｌ，摇匀后，分装，１１５℃灭菌３０分钟。
４．普通肉汤培养基
蛋白胨 １０ｇ
氯化钠 ５ｇ
肉浸液 １０００ｍｌ
取蛋白胨、氯化钠，加入肉浸液内，微温溶解后，调节ＰＨ为弱碱性，煮沸、滤清，调节ＰＨ值使灭菌后为７．２±０．２，分装，１１５℃灭菌３０分钟。
５．普通肉汤琼脂培养基
照上述普通肉汤培养基的处方及制法，加入１５～２０ｇ琼脂，调节ＰＨ值使灭菌后为７．２±０．２，分装，１１５℃灭菌３０分钟。
６．０．５％葡萄糖肉汤培养基
蛋白胨 １０ｇ
氯化钠 ５ｇ
葡萄糖 ５ｇ
肉浸液 １０００ｍｌ
取蛋白胨与氯化钠加入肉浸液内，微温溶解后，调节ＰＨ为弱碱性，煮沸，加葡萄糖溶解后，摇匀，滤清，调节ＰＨ值使灭菌后为ＰＨ７．２±０．２，分装，１１５℃灭菌３０分钟。
上述培养基分别按１５ｍｌ与４０ｍｌ分装于试管中，装量为试管高度的２／５，然后按上述温度、时间灭菌。细菌培养基经３０～３５℃培养４８小时，霉菌培养基经２０～２５℃培养后，应无菌生长。
培养基的质量应通过以下检查
（１）液体硫乙醇酸盐培养基经接种１ｍｌ含１００个以下的藤黄八叠球菌〔ＣＭＣＣ（Ｂ）２８００１〕的菌液，置３０～３５℃培养２４小时后，应生长良好。
（２）液体硫乙醇酸盐培养基经接种１ｍｌ含５０个以下的生孢梭菌〔ＣＭＣＣ（Ｂ）６４９４１〕的菌液，置３０～３５℃培养２４小时后，应生长良好。
（３）霉菌培养基经接种１ｍｌ含５０个以下的白色念珠菌菌液，置２０～２５℃培养２４小时后，应生长良好。
〔附注〕肉浸液制备法：取新鲜牛肉，除去肌腱及脂肪，切细，绞碎后，每１０００ｇ加水３０００ｍｌ，充分拌匀，在２～１０℃浸泡２０～２４小时，煮沸１小时，滤过，压干肉渣，补足液量，分装，１２１℃灭菌３０分钟，置冷暗处备用。也可用牛肉浸膏３ｇ，加水１０００ｍｌ，配成溶液代替。
对照用菌液
金黄色葡萄球茵（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）菌液：取
金黄色葡萄球茵〔ＣＭＣＣ（Ｂ）２６００３〕的普通肉汤琼脂斜面新鲜培养物１白金耳，接种至液体硫乙醇酸盐培养基内，在３０～３５℃培养１６～１８小时后，用灭菌的生理盐水稀释成１０－６。
检查法
１．供试品如为注射液，供角膜创伤及手术用的滴眼剂或灭菌溶液。任取供试管２支（瓶）以上，用适当消毒液清洁供试品容器的外表面，以无菌操作吸取规定接种量的供试品溶液，分别接种于液体硫乙醇酸盐培养基５管，其中１管接种金黄色葡萄球菌菌液１ｍｌ，供作阳性对照；另接种于霉菌培养基２管。供试品溶液的每管接种量与培养基的分装量，应根据供试品的装量，接下列规定取用：
供试品装置 每管接种量 培养基分装量
２ｍｌ或２ｍｌ以下 ０．５ｍｌ １５ｍｌ
２ｍｌ以上至２０ｍｌ １．０ｍｌ １５ｍｌ
２０ｍｌ以上 ５．０ｍｌ ４０ｍｌ
接种后轻轻摇动，使匀，液体硫乙醇酸盐培养基在３０～３５℃培养５日，霉菌培养基在２０～２５℃培养７日，抗生素药品培养７日，放射性药品培养８～１４日，培养期间应逐日检查是否有菌生长（阳性对照在２４小时内应有细菌生长）；如在加入供试品溶液后，培养基出现浑浊或沉淀，经培养后不能从外观上判断时，可取该培养液接种另１支相同的培养基中或斜面培养基上，培养４８～７２小时后，观察是否再现浑浊或在斜面上有无菌落生长，并在转种的同时，取培养液少量，涂片制成染色标本，用显微镜观察是否有菌生长。
２．供试品如为注射用灭菌粉末或冷冻干燥的无菌制品。照该药品项下的规定或按药品“剂量”项下的溶剂用量，加入灭菌的水或灭菌生理盐水，使内容物溶解成均匀的供试品溶液，取规定接种量的供试品溶液，接种于上述培养基中。
３．供试品如为直接供分装注射用的原料药品。按各该药品项下的规定制成溶液，依法接种于培养基中。
４．供试品如为外科敷料。取供试品２个包装，以无菌操作拆开包装，于不同部位剪取约１ｃｍ×３ｃｍ的样品，分别接种于４０ｍｌ培养基中。
５．供试品如有抑菌作用或含有抑菌物质时，可选用适宜的培养基，或种入较大量的培养基中，使该供试品稀释至不具有抑菌作用的浓度，或照下述“薄膜过滤法”处理并接种于培养基中。
６．供试品如为抗生素药品。取供试品不少于２瓶（支）或２份（原料药），分别按该药品项下规定的方法处理后，种入每管装量为４０ｍｌ的培养基中，分别依法检查。
（１）青霉素酶法 取规定量的供试品，加入足够使青毒素灭活的无菌青霉素酶溶液，使成约１０ｍｌ，分别等量接种于培养基中。
（２）薄膜过滤法 取规定量的供试品，加入灭菌生理盐水１００ｍｌ或其他适宜的溶剂中，摇匀，以无菌操作加入装有直径约５０ｍｍ，孔径不大于０．４５±０．０２μｍ微孔滤膜的薄膜过滤器内，减压抽干后，用灭菌生理盐水或其他适宜的溶剂冲洗薄膜３次，每次１００ｍｌ。取出薄膜，分成４片，取３片分别放在３管液体硫乙醇酸盐培养基中，其中１管接种金黄色葡萄球菌菌液１ｍｌ，供作阳性对照，另１片放在霉菌培养基管中。
７．供试品如为放射性药品 取供试品１瓶（支），以每管接种量为０．２ｍｌ，接种于每管装量为７．５ｍｌ的培养基中。
结果的判断
当阳性对照管显浑浊并确有细菌生长时，可根据观察所得结果判定：如液体硫乙醇酸盐及霉菌培养管均为澄清或虽显浑浊但经证明并非有菌生长，均应判为供试品合格。如液体硫乙醇酸盐及霉茵培养管中任何１管显浑浊并确证为有菌生长，应重新取样，分别依法复试２次，除阳性对照管外，其他各管均不得有菌生长，否则应判为供试品不合格。
附录
一、常用检验设备及器材
恒温培养箱 ３０～３５℃ ３６±１℃
霉茵培养箱 ２５～２８℃
恒温水浴箱 ４５±１℃
净化工作台
生物显微镜 １５００×
体视显微镜或放大镜
电冰箱
电热干燥箱 ２５０～３００℃
高压蒸汽消毒器
药物天平
匀浆仪或研钵
锥形瓶 １００ｍｌ，２５０ｍｌ，５００ｍｌ
直形吸管 １ｍｌ，１０ｍｌ
试管 １３×１００ｍｍ，
１８×１８０ｍｍ，３０×２００ｍｍ
培养皿 ９ｃｍ
陶瓦盖 １２ｃｍ
量筒 １００ｍｌ，５００ｍｌ，１０００ｍｌ
滤器及微届滤膜
（孔径０．４５±０．０２μｍ）
注射器 １ｍｌ，５ｍｌ，１０ｍｌ，３０ ｍｌ
载玻片及盖玻片
接种针及接种环
试管架
酒精灯
二、染色法 稀释剂 指示剂及试剂
１．染色法
１．１ 革兰氏染色法
１．１．１ 染液配制
（１）结晶紫染液：
结晶紫（Ｃｙｓｔａｌ ｖｉｏｌｅｔ） １．０ｇ
９５％乙醇 ２０ｍｌ
１％草酸铵［（ＮＨ4）2Ｃ2Ｏ4］水溶液 ８０ｍｌ
将结晶紫溶解于９５％乙醇中后，与草酸铵溶液相混合，静置４８小时使用。此染液稳定，置密闭的棕色瓶中可储存数月。
（２）革兰氏碘液：
碘片［Ｉ2］ １．０ｇ
碘化钾［ＫＩ］ ２．０ｇ
蒸馏水 ３００ｍｌ
先用３～５ｍｌ蒸馏水溶解碘化钾，再加入碘片，待全部溶解后，加蒸馏水稀释至３００ｍｌ。置密闭棕色瓶中，备用。
（３）脱色液：９５％乙醇
（４）沙黄（番红）染液
沙黄（Ｓａｆｒａｍｉｎｅ Ｏ） ０．２５ｇ
９５％乙醇 １０ｍｌ
蒸馏水 适量
将沙黄溶解于９５％乙醇中，待完全溶解再加蒸馏水至１００ｍｌ。
１．１．２ 染色法
（１）用接种环沾取无菌水，置于洁净载玻片上，再挑取少许菌苔，轻轻研开，使均匀。
（２）涂片自然风干或微热烤干，而后通过火焰２～３次以固定涂片。
（３）滴加结晶柴染液，染色１分钟，水洗 。
（４）滴加碘液、媒染１分钟，水洗、甩干余水。
（５）滴加９５％乙醇脱色，约２０～３０秒，或将９５％乙醇滴满整个涂片，立即倾去，再用乙醇滴满涂片脱色１０秒钟，水洗、吸干。
（６）滴加沙黄复染液，染１分钟，水洗，待干。
（７）镜检
１．１．３ 染色结果
革兰氏阳性菌呈蓝紫色
革兰氏阴性菌呈红色
１．１．４ 注意事项
（１）玻片必须洁净，涂片宜薄而匀，菌量不可浓，否则，看不清单个菌体形态。
（２）待检菌菌龄以１８～２４小时为宜，革兰氏阳性茵易受菌龄影响，老化细胞易呈阴性。
（３）脱色是本法的关键步骤，脱色不足易染成阳性，脱色过度易染成阴性。
１．２ 鞭毛染色法
１．２．１ 染液配制
（１）甲液：
鞣酸（丹宁酸） ５．０ｇ
氯化铁（ＦｅＣｌ3） １．５ｇ
１５％甲醛 ２．０ｍｌ
１％氢氧化钠（ＮａＯＨ） １．０ｍｌ
蒸馏水 １００ｍｌ
先将鞣酸、氯化铁溶于蒸馏水中，再加入氢氧化钠与甲醛液
（２）乙液：
硝酸银（ＡｇＮＯ3） ２．０ｇ
蒸馏水 １００ｍｌ
取出１０ｍｌ硝酸银溶液，备用。向余下９０ｍｌ硝酸银溶液滴加浓氢氧化铵［ＮＨ4ＯＨ］， 使现浓厚的沉淀，再继续滴加至刚出现澄清状态为止。再将备用硝酸银溶液谨慎地逐滴滴加到已澄清的溶液中，此时呈现薄雾；轻摇则消失，继续边滴加边摇动，使澄清液略显不消散的薄雾为止。如雾重，则银盐沉淀，不宜使用。
１．２．２ 染色法
（１）将待检菌事先接种于新制备的普通肉汤琼脂斜面上，置３７℃培养１６～２０小时。
（２）在洁净无痕的载玻片中部及与之相隔斜上１ｃｍ处，用接种环沾取一环蒸馏水，然后用接种环从待检菌斜面湿润处挑取培养物少许于斜上方的水滴中，略倾斜玻片，使上位水滴自然流动至中部水滴中，使培养物自然扩散至中部水滴中，前后操作均不应研磨或搅动，任其自然干燥。固定。
（３）在干燥涂片上加甲液。染３～５分钟，用蒸馏水轻轻冲洗，将残水沥干或用乙液冲去残水后，加适量乙液，保持３０～６０秒钟，染色时宜在酒精灯上适当加温，使染液出现蒸气为宜，勿使出现干燥。蒸馏水冲洗。
（４）镜检：在菌体分布均匀、清晰处观察。
１．２．３ 染色结果：菌体及鞭毛皆染成茶色。
１．２．４ 注意事项
（１）染液随用随配、隔日效果则差。
（２）一定要充分洗净甲液后，再加乙液，否则背景较脏。
（３）防止水及培养物沾有氯化物。
（４）切忌用接种环涂研培养物。
（５）玻片要洁净，不得有油污。玻片应先在含洗衣粉的水中煮沸，玻片间不应重叠，以免去污不净。煮后水洗，放置于清洁液中，浸泡２４小时，取出充分水洗，除去残酸，沥干，存放于９５％乙醇中备用。玻片洁净与否对本染色极为关键。
（６）染色过程中加温最好置于金属板上均匀加温。
１．３ 芽孢染色法
１．３．１ 染液配制
（１）石炭酸复红液
碱性复红（Ｆｕｃｈｓｉｎ ｂａｓｉｃ ） ０．４ｇ
９５％乙醇 １０ｍｌ
５％酚溶液 ９０ｍｌ
将碱性复红溶于９５％乙醇中后，与５％酚溶液９０ｍｌ相混合。
（２）碱性美蓝（亚甲蓝）溶液
美蓝（Ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ ｂｌｕｅ） ０．６ｇ
９５％乙醇 ３０ｍｌ
０．０１％氢氧化钾（ＫＯＨ）水溶液 １００ｍｌ
将美蓝溶于９５％乙醇中后，与０．０１％氢氧化钾水溶液１００ｍｌ相混合。
１．３．２ 染色法
（１）涂片、干燥、固定。
（２）滴满石炭酸复红染液并于酒精灯火焰上加热，使染液冒气约５分钟，待冷，水洗，并用９５％乙醇脱色３０秒钟，水洗，再加碱性美蓝溶液染色３０秒钟，水洗、待干。
（３）镜检
１．３．３ 染色结果
芽孢为红色、菌体为蓝色
１．３．４ 注意事项：加热时勿使染液干涸，可续加石炭酸复红染液。
１．４ 乳酸复红染色法
１．４．１ 染液配制
酸性复红（Ｆｕｃｈｓｉｎ ａｃｉｄ） ０．１ｇ
乳酸 １００ｍｌ
将两份混合、溶解即得。
１．４．２ 染色法：滴加染液于载玻片上，挑取待检菌于染液中，置显微镜下观察。真菌菌丝染成淡红色。
１．４．３ 用途 供真菌菌丝体染色或镜检时介质用。
１．５ 乳酸棉蓝染色液
１．５．１ 染液配制
苯酚 ２０．０ｇ
乳酸 ２０．０ｍｌ
甘油 ４０ｍｌ
棉蓝（苯胺蓝（水溶））（Ｃｏｔｔｏｎ ｂｌｕｅ） ０．０５ｇ
蒸馏水 ２０ｍｌ
将酚、乳酸、甘油混合，徐徐加热溶解后，加入棉蓝混匀溶解。
１．５．２ 染色法 滴加染液于载玻片上，挑取待检菌于染液中，置显微镜下观察。真菌菌丝染成蓝色。
１．５．３ 用途 供真菌染色用。若不加棉蓝即为乳酸苯酚液，可供作霉菌镜检时的介质。
２．稀释剂
２．１ 生理盐水
氯化钠 ９ｇ
蒸馏水 １０００ｍｌ
